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          Science封面| 冷凍超分辨與FIB-SEM結合新技術:三維蛋白超微結構可視化

          儀器信息網 2020/01/17 17:07:38 點擊 2805 次
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          [導讀] 2020年1月16日,《Science》雜志刊登了一項關于融合超分辨率熒光和電子顯微鏡技術的顯微表征新技術成果——冷凍超分辨-FIB-SEM聯用,可以在整個細胞的三個維度上可視化蛋白質-超結構關系。

            儀器信息網訊 2020年1月16日,《Science》雜志刊登了美國科學家David Hoffman和Gleb Shtengel在Hess和加州大學伯克利分校高級研究員Eric Betzig的指導下的一項關于融合超分辨率熒光和電子顯微鏡技術的顯微表征新技術成果,該技術稱為cryo-SR / EM,結合使用超低溫超高分辨率熒光顯微鏡和聚焦離子束銑削掃描電子顯微鏡,可以在整個細胞的三個維度上可視化蛋白質-超結構關系。憑借其重要性,該研究也榮登本期《科學》雜志封面。

          Eric Betzig同時也是該文章的通訊作者,Eric Betzig何許人也?他正是2014 年諾貝爾化學獎得主,獲獎理由是實現了單分子水平的超高分辨率熒光顯微技術。

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            封面為哺乳動物小腦顆粒神經元的半透明彩色核,這張3D效果圖展示了由電子顯微鏡(EM)和低溫超分辨率熒光顯微鏡所成像的組蛋白重疊所定義的特異性異染色質亞區類型。圍繞細胞核的半透明薄殼代表核膜,而3D渲染的電鏡數據(灰色)薄片則穿過細胞核。右下角的圓圈是線粒體的剖視圖。

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            一種新的顯微鏡技術將電子顯微鏡和光學顯微鏡相結合,以生成細致的三維細胞圖像,如圖所示。圖片來源:D. Hoffman et al./Science 2020

            有觸須的的囊泡在很小的空間內穿梭負責將“貨物”進行分類,相鄰的神經元通過類似網絡的界面相互依附。隨著干細胞分化成神經元,DNA在核內重新排列。而一項新的顯微鏡技術可以將所有這些細節展現得淋漓盡致。

            這項技術被稱為cryo-SR/EM,它將電子顯微鏡和超分辨率光學顯微鏡捕捉到的圖像融合在一起,以3D的形式呈現出細胞內部明亮、清晰、詳細的圖像。

            技術背景

            多年來,科學家一直在探索細胞內部的微觀世界,開發新的工具來觀察這些基本的生命單位。但是每種工具都需要綜合權衡。光學顯微鏡可以通過熒光分子標記特定細胞結構能夠輕松識別,隨著超分辨(SR)熒光顯微鏡的發展,可以更加清晰的觀察這些結構。但是,在一個給定的時間內,熒光只能揭示細胞中10000多種蛋白質中的一小部分,因此很難理解這幾種蛋白質與其他物質之間的關系。另一方面,電子顯微鏡(EM)可以在高分辨率的圖片中顯示出所有的細胞結構——但是僅僅通過EM來描述一個特征與其他特征是很困難的,因為細胞內部的空間是如此的擁擠。

            霍華德·休斯醫學研究所珍妮莉亞研究園區的高級負責人Harald Hess說,“將這兩種技術結合在一起,可以使科學家清楚地了解特定細胞特征如何與其周圍環境相關聯,這是一種非常強大的方法!

            Janelia科學家David Hoffman和高級科學家Gleb Shtengel在Hess和加利福尼亞大學伯克利分校HHMI研究人員Eric Betzig的高級研究員Eric Betzig的帶領下率先開展了該項目。

            首先,科學家在高壓下冷凍細胞。這樣可以迅速停止細胞的活動,防止冰晶的形成,而冰晶會破壞細胞并破壞成像的結構。接下來,研究人員將樣品置于低溫室中,在絕對零度以上10度的溫度下,用超分辨率熒光顯微鏡對樣品進行三維成像。然后,它們被移除,嵌入樹脂中,并在Hess實驗室開發的強大電子顯微鏡中成像,該顯微鏡向細胞表面發射一束離子,一點一點地研磨,同時為每一層新暴露的細胞拍照。然后,計算機程序將這些圖像拼接成三維重構的圖像。

            最后,研究人員疊加了兩個顯微鏡的三維圖像數據。結果:令人震驚的圖像以驚人的清晰度揭示了細胞的內部細節。

            下面,此圖像的一些示例說明了科學家如何使用該技術。 “已經引起了很多興趣,” Hess說, “還有很多實驗要做——整個世界的細胞都需要研究!

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            全細胞相關成像。高壓冷凍細胞的低溫超高分辨率熒光顯微鏡與聚焦離子束掃描電子顯微鏡(FIB-SEM)結合使用,可以在全局超微結構背景下對蛋白質進行多色三維納米可視化。 從左上方順時針方向:體積渲染的細胞,具有線粒體和內質網(ER)蛋白相關的正交排列(插圖); 形態各異的溶酶體區室;由轉錄活性的蛋白質報道分子定義的異染色質亞結構域;與小腦接觸處膜粗糙度相關的粘附蛋白顆粒神經元;過氧化物酶體(粉紅色)與ER薄片(紅色)和線粒體(青色)并置。

            在細胞開始(成年)之前(左)和之后(右),神經元的細胞核看起來截然不同。隨著細胞的成熟,DNA被重新包裝在細胞核內以開啟新的一組基因。這些變化反映在兩個細胞內部的灰色斑點和彩色熒光的不同模式中。 “這項技術為分化前后的細胞核狀態提供了驚人的詳細快照,”參與該項目的圣猶達兒童研究醫院的David Solecki表示。圖片來源:D. Hoffman et al./Science 2020

            發育中的神經元粘在一起。這段視頻準確地展示了這些細胞是如何相互粘附的,揭示了類似瑞士奶酪一樣的聯系,幫助年輕的神經元正確地遷移到它們在神經系統中的最終目的地。黏附蛋白的紫色和綠色超分辨熒光圖像與電子顯微鏡下詳細顯示膜結構的圖像相互關聯。資料來源: D. Hoffman et al./Science 2020

            細胞內充滿了小囊泡——這是一種膜囊,幫助細胞儲存蛋白質、分解細胞垃圾和運輸貨物。僅在電子顯微鏡下,這些不同種類的囊泡是無法區分的。但通過cryo-SR / EM,它們的明顯特征變得清晰起來。這段視頻放大了核內體,核內體負責將貨物運送到細胞內的不同區域。資料來源: D. Hoffman et al./Science 2020


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